熒光顯微鏡是光學(xué)顯微鏡的一種特殊形式。它利用熒光染料在被特定波長的光激發(fā)后發(fā)光的能力。感興趣的蛋白可以通過抗體染色或用熒光蛋白標(biāo)記而用此類熒光染料標(biāo)記。它可以確定單個分子種類的分布，數(shù)量及其在細胞內(nèi)的定位。此外，可以進行共定位和相互作用研究，使用可逆結(jié)合的染料（例如Ca2+和fura-2）觀察離子濃度，并觀察到細胞內(nèi)吞作用和胞吐作用。如今，借助熒光顯微鏡甚至可以對亞分辨率的顆粒成像。
斯托克斯轉(zhuǎn)移
熒光的重要特征是斯托克斯頻移。它描述了激發(fā)光子和發(fā)射光子的能級差異。熒光染料發(fā)出的光子比激發(fā)光子具有更大的波長。這是由于在激發(fā)熒光染料之后但在發(fā)射光子之前，能量向周圍環(huán)境釋放。產(chǎn)生的波長偏移可以區(qū)分激發(fā)光和發(fā)射光。能量的吸收和發(fā)射可以看作是分子種類的特定特征。
熒光顯微鏡
熒光顯微鏡（正置或倒置）類似于普通的光學(xué)顯微鏡，不同之處在于照明是由激光作為單色光或明亮而強大的光源（如水銀蒸氣或氙弧燈）提供的。此外，它還包含一個激發(fā)激發(fā)塊和一個發(fā)射激發(fā)塊。激發(fā)濾光片僅透射能夠用其特定染料激發(fā)樣品的光。樣本發(fā)出的光在到達檢測器之前必須通過發(fā)射濾光片。發(fā)射濾光片僅對具有不同波長的光（如樣品發(fā)出的光）是半透明的。
熒光顯微鏡的光路
近年來，LED（發(fā)光二極管）也已經(jīng)用作熒光顯微鏡的光源。LED發(fā)出的光的波長取決于生產(chǎn)所用的材料。但是，在大多數(shù)情況下，由于LED通常會在相當(dāng)寬的波長范圍內(nèi)發(fā)光，因此需要激發(fā)濾光片。
大多數(shù)熒光顯微鏡是落射熒光顯微鏡。照明器和物鏡位于樣品的同一側(cè)，并且光線不穿過樣品。除了激發(fā)和發(fā)射濾光片，這種熒光顯微鏡還需要一個二向色鏡。二向色鏡允許特定波長的光通過，而其他波長的光被反射。通常將濾光片和二向色鏡插入濾光片立方體中。
轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎
激發(fā)塊的結(jié)構(gòu)
激發(fā)光穿過激發(fā)濾光片并被導(dǎo)向二向色鏡。這將光通過物鏡反射到樣品。樣品中的熒光染料被激發(fā)并發(fā)射光子。該發(fā)射光通過物鏡返回至二向色鏡。發(fā)出的光具有適當(dāng)?shù)牟ㄩL并且能夠通過。樣品反射的激發(fā)光無法通過二向色鏡，將被阻擋。如果激發(fā)光能夠通過二向色鏡，則當(dāng)?shù)竭_發(fā)射濾光器時會被阻擋。可以通過檢測器測量通過發(fā)射濾光片的光。
熒光顯微鏡中使用了不同類型的濾光片?？梢詤^(qū)分帶通，長通和短通激發(fā)塊。帶通濾光片會透射一個波長帶，而波長更大或更小的光將被阻擋。長通和短通激發(fā)塊是邊緣激發(fā)塊。長通濾光片透射長波長的光。波長超過某個截止值的光將無法通過。相反，短通濾光片可傳輸短波長并阻擋長波長。
熒光顯微鏡已被廣泛使用并具有很高的特異性。各種技術(shù)可以解決不同的問題，甚至可以規(guī)避ErnstAbbe所描述的衍射極限。
染色體的熒光原位雜交。紅色：TRITC，藍色：CY5，綠色：FITC
分子種類的定位可以通過細胞器（例如細胞骨架或膜）的共染色來確定。共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）使得觀察標(biāo)本區(qū)域成為可能，而沒有來自焦平面外部的信號，并且可以進行光學(xué)切片。全內(nèi)反射（TIRF）顯微鏡是一種允許觀察靠近細胞表面的薄區(qū)域的技術(shù)。e逝場激發(fā)該區(qū)域的熒光染料。
觀察分子種類動態(tài)的一種技術(shù)是光漂白后的熒光恢復(fù)（FRAP）。對受限區(qū)域的熒光染料進行光漂白，可以測量未漂白分子向該區(qū)域的擴散。相互作用研究可通過熒光能量轉(zhuǎn)移（FRET）顯微鏡進行。激發(fā)的供體生色團可以將能量轉(zhuǎn)移到受體熒光染料上并激發(fā)它。只有將兩者緊密結(jié)合在一起才有可能。如果這些染料與不同的蛋白質(zhì)偶聯(lián)，則只有當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)彼此相互作用時，它們才能傳遞能量并發(fā)出熒光。
允許亞分辨率圖像的技術(shù)包括受激發(fā)射耗竭（STED）顯微鏡，基態(tài)耗竭（GSD）顯微鏡，單分子和基態(tài)耗竭顯微鏡，然后是單個分子返回（GSDIM），以及光激活定位顯微鏡（PALM）和隨機光學(xué)重建顯微鏡（STORM）。用于這些技術(shù)的亞分辨率顯微鏡也稱為納米顯微鏡，因為它們可以分辨納米級的圖像。
