寬視野熒光顯微鏡通常用于可視化生命科學(xué)標(biāo)本中的結(jié)構(gòu)并獲得有用的信息。通過(guò)使用熒光蛋白或染料，可以以高度特異性的方式標(biāo)記不連續(xù)的樣品成分。為了完全理解結(jié)構(gòu)，可能需要在3維上對(duì)其進(jìn)行可視化，但是在使用顯微鏡進(jìn)行成像時(shí)會(huì)面臨某些挑戰(zhàn)。

    要?jiǎng)?chuàng)建結(jié)構(gòu)的3D圖像，必須考慮到光學(xué)器件的視場(chǎng)和景深有限，因此要獲取來(lái)自對(duì)焦區(qū)域和離焦區(qū)域的信號(hào)信息。另外，可能發(fā)生衍射。散焦和散射光會(huì)導(dǎo)致形成“模糊”圖像。

    從歷史上看，去卷積技術(shù)已用于消除散焦光。現(xiàn)在，有一種計(jì)算清算技術(shù)，它是一種創(chuàng)新的徠卡光電技術(shù)，超越了反卷積技術(shù)，可提供更清晰的圖像和更逼真的結(jié)構(gòu)3D表示。

    問(wèn)題：為什么圖像模糊？

    每個(gè)熒光顯微鏡用戶都希望擁有盡可能多的感興趣結(jié)構(gòu)的詳細(xì)信息。這里的問(wèn)題在于光學(xué)系統(tǒng)產(chǎn)生逼真的圖像的能力有限。所有光源，例如樣本中的熒光蛋白，都會(huì)發(fā)出散射光。在實(shí)踐中，根據(jù)樣品的厚度，散射會(huì)導(dǎo)致信號(hào)模糊。為了克服這個(gè)問(wèn)題，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了不同的方法。

    消除帶針孔的焦點(diǎn)光

    共聚焦顯微鏡通過(guò)在激發(fā)和發(fā)射光路中使用小孔的精密定位來(lái)排除離焦信息。這種方法導(dǎo)致較大的垂直（z）分辨率（較小的焦點(diǎn)深度），并消除了散焦信號(hào)的影響。由于樣品中每個(gè)可視化點(diǎn)的共焦體積較小（光學(xué)切片），因此，在采集了樣品的所有光學(xué)切片后便創(chuàng)建了最終圖像。因此，更長(zhǎng)的圖像獲取時(shí)間抵消了高分辨率的好處。

    寬視野熒光顯微鏡

    常規(guī)的寬視野顯微鏡沒(méi)有針孔，并且可以同時(shí)收集焦點(diǎn)內(nèi)和焦點(diǎn)外的光信號(hào)。它提供了快速的圖像采集，但分辨率較低。

    歷史解決方案：通過(guò)反卷積獲得更清晰的圖像

    為了了解如何解決寬視場(chǎng)圖像中的模糊問(wèn)題，從看一個(gè)很小的樣本開(kāi)始是有意義的，例如圓形乳膠珠，其尺寸低于顯微鏡的分辨率極限。用顯微鏡在橫向（xy）方向觀察此3D熒光樣品，觀察者會(huì)看到周圍模糊的發(fā)光點(diǎn)投影（圖1）。z堆棧的采集結(jié)果如下圖所示：珠子的側(cè)視圖類似于兩個(gè)圓錐體，它們彼此頂部重疊。此結(jié)果歸因于雜散光，該雜散光在z堆棧采集期間記錄。可以從信號(hào)數(shù)據(jù)中減去該“錯(cuò)誤”信息，從而產(chǎn)生真正代表實(shí)際磁珠的圖像。

    使用寬視場(chǎng)顯微鏡在橫向（xy）和垂直（xz）平面上點(diǎn)光源的投影

    使用寬視場(chǎng)顯微鏡在橫向（xy）和垂直（xz）平面上點(diǎn)光源的投影。非常小的發(fā)熒光的乳膠珠代表點(diǎn)光源。在此寬視場(chǎng)顯微鏡圖像中無(wú)法再現(xiàn)其完美的圓形。由于雜散光，珠子的xy視圖顯示周圍有些模糊。在獲取z堆棧后，xz投影使該珠看起來(lái)像沙漏形狀。用顯微鏡觀察時(shí)，點(diǎn)對(duì)象的變形是普遍現(xiàn)象。

    點(diǎn)擴(kuò)散功能（PSF）

    為了理解該過(guò)程的基礎(chǔ)，有必要引入一個(gè)特殊術(shù)語(yǔ)，該術(shù)語(yǔ)在進(jìn)行反卷積時(shí)經(jīng)常使用：點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)（PSF）。

    原則上，圖1中出現(xiàn)的變形現(xiàn)象是由于光學(xué)顯微鏡生成點(diǎn)光源的代表性圖像的能力有限所致。穿過(guò)顯微鏡透鏡的光信號(hào)會(huì)根據(jù)光學(xué)系統(tǒng)的設(shè)置，光的波長(zhǎng)，物鏡及其數(shù)值孔徑（NA），浸沒(méi)介質(zhì)的折射率和其他參數(shù)而失真。所有這些影響的結(jié)果（與它們對(duì)光學(xué)系統(tǒng)產(chǎn)生的最終圖像的影響有關(guān)）被描述為點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（圖2A和2B）。從物理上講，人們可以認(rèn)為樣品是被PSF纏繞（折疊）的。同時(shí)，通過(guò)了解PSF，可以從PSF中“展開(kāi)”樣品。這種“展開(kāi)”稱為反卷積。

    用寬視野顯微鏡拍攝的點(diǎn)對(duì)象（非常小的圓形乳膠珠）的圖像和z堆棧

    用寬視野顯微鏡拍攝的點(diǎn)對(duì)象（非常小的圓形乳膠珠）的圖像和z堆棧。圖像受幾個(gè)參數(shù)的影響，例如系統(tǒng)設(shè)置，數(shù)值孔徑和浸沒(méi)介質(zhì)的折射率。導(dǎo)致圖像失真的所有因素都可以通過(guò)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（PSF）來(lái)描述。該對(duì)象可被認(rèn)為是與PSF混淆的。如果知道PSF，則可以進(jìn)行反卷積。

    用共聚焦顯微鏡記錄的非常小的乳膠珠的PSF

    用共聚焦顯微鏡記錄的非常小的乳膠珠的PSF。它是通過(guò)收集垂直（xz）平面中的強(qiáng)度生成的。PSF是一種衍射圖，其核心形狀控制著共聚焦顯微鏡的光學(xué)分辨率。

    現(xiàn)在的問(wèn)題是：如何確定PSF？通常通過(guò)計(jì)算來(lái)估計(jì)PSF。當(dāng)提供諸如激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)峰值以及顯微鏡物鏡的數(shù)值孔徑（NA）之類的信息時(shí)，可以通過(guò)計(jì)算機(jī)算法來(lái)計(jì)算PSF的理論值。

    超越反卷積：計(jì)算清算

    徠卡顯微系統(tǒng)公司的THUNDERImager技術(shù)可實(shí)時(shí)提供厚的生物樣本的圖像，并具有鮮明的對(duì)比度，而不會(huì)出現(xiàn)廣角鏡系統(tǒng)常見(jiàn)的霧霾或散焦模糊。它使用了一種稱為計(jì)算清算的方法，該方法超越了反卷積方法。計(jì)算清算實(shí)時(shí)檢測(cè)并消除了失焦區(qū)域中的有害信號(hào)，并清楚地揭示了感興趣的聚焦區(qū)域中的所需信號(hào)。它通過(guò)樣本特征尺寸的差異來(lái)區(qū)分散焦和聚焦信號(hào)。特征尺寸和所有相關(guān)的光學(xué)參數(shù)將自動(dòng)考慮在內(nèi)。對(duì)于通常不適合使用標(biāo)準(zhǔn)廣角系統(tǒng)成像的標(biāo)本，計(jì)算清除方法可以成功地以清晰的焦點(diǎn)和對(duì)比度可視化細(xì)節(jié)。而且，它可以與圖像恢復(fù)方法結(jié)合使用。