數字圖像的空間分辨率與圖像的空間密度和用于捕獲圖像的顯微鏡的光學分辨率有關。數字圖像中包含的像素數量以及每個像素之間的距離稱為采樣間隔，這取決于數字化設備的精度。光學分辨率是對顯微鏡分辨原始樣本中細節的能力的度量，除空間密度（數字圖像中的像素數量）外，還與光學，傳感器和電子設備的質量有關。 。在顯微鏡的光學分辨率優于空間密度的情況下，所得數字圖像的空間分辨率僅受空間密度限制。

   數字圖像中包含的所有細節，從非常粗糙到非常精細，都是由亮度過渡組成的，該過渡在明暗級別之間循環。亮度轉換之間的循環速率稱為圖像的空間頻率，較高的速率對應于較高的空間頻率。通過顯微鏡觀察到的樣品中亮度的變化水平是常見的，背景通常由均勻的強度組成，并且樣品表現出光譜的亮度水平。在強度相對恒定的區域（例如背景），空間頻率在整個視場中僅略有變化。另外，許多標本細節通常會表現出極度的明暗變化，其間存在很大的強度范圍。

   數字圖像中每個像素的數值表示在采樣間隔內平均的光學圖像的強度。因此，背景強度將由相對均勻的像素混合組成，而樣本通常包含的像素值范圍從非常暗到非常亮。數碼相機系統準確捕獲所有這些細節的能力取決于采樣間隔。在顯微鏡中看到的小于數字采樣間隔（具有較高空間頻率）的特征將無法在數字圖像中準確表示。所述奈奎斯特準則需要一個取樣間隔等于兩倍的最高樣本空間頻率精確地保持所得到的數字圖像中的空間分辨率。等效措施是Shannon的采樣定理，指出數字化設備必須使用不大于光學圖像最小可分辨特征尺寸一半的采樣間隔。因此，要捕獲樣本中存在的最小細節度，必須以足夠快的速率進行采樣，以使每個特征至少要收集兩個樣本，從而確保空間周期的明暗部分都被樣本收集。成像設備。

   如果以比奈奎斯特準則或香農定理所要求的速度慢的速度對樣本進行采樣，則最終數字圖像中將無法準確地表示具有高空間頻率的細節。在光學顯微鏡中，光學圖像分辨率的阿貝極限為0.22微米，這意味著數字化儀必須能夠以與樣品空間中0.11微米或更小的間隔進行采樣。在每條水平掃描線的512個點對樣本進行采樣的數字化儀將產生約56微米（512 x 0.11微米）的最大水平視場。如果利用太少的像素來采集樣本，那么包含樣本的所有空間細節將不會出現在最終圖像中。反過來，過度采樣。從理論上講，多余的像素不會對空間分辨率有所貢獻，但通常可以幫助提高從數字圖像獲取的特征測量的準確性。為了確保為高分辨率成像提供足夠的采樣，建議最小可分辨特征的采樣間隔為2.5到3個。

   大多數與現代顯微鏡相連的數碼相機都有固定的最大采樣間隔，無法調整為與樣本的空間頻率匹配。選擇能夠滿足顯微鏡放大倍率和樣本特征的最低空間分辨率要求的照相機和數字轉換器的組合非常重要。如果采樣間隔超過特定樣本所需的間隔，則生成的數字圖像將包含比所需更多的數據，但是不會丟失空間信息。

   在本教程中，隨著“像素尺寸”滑塊向右移動，數字圖像的空間頻率會線性降低。利用的空間頻率范圍從175 x 175像素（總共30,625個像素）到6 x 6像素（總共36個像素），以在頻域內提供廣泛的可能分辨率。當滑塊向右移動（減少數字圖像中的像素數量）時，將以越來越低的空間頻率對樣本細節進行采樣，并且圖像細節會丟失。在最低的空間頻率下，會發生像素阻塞（通常稱為pixelation）并掩蓋大多數圖像特征。