在活細胞小鼠胚胎卵母細胞中研究細胞焦亡，可從構建基因敲除小鼠模型、利用生物化學方法分析、使用細胞生物學和分子生物學技術、借助電鏡觀察細胞形態、檢測焦亡相關蛋白和炎癥因子等方面入手，以下是具體說明：

1.基因敲除小鼠模型：構建Gasdermin D（GSDMD）基因敲除小鼠，觀察這些小鼠在感染或炎癥因子下的免疫反應和細胞焦亡情況。通過與野生型小鼠的對比，可以探究GSDMD在細胞焦亡過程中的關鍵作用，以及其對機體免疫反應的影響。這一方法有助于明確特定基因在細胞焦亡中的功能，為后續研究提供基礎。

2.生物化學方法：通過體外實驗，探究Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11等蛋白的激活條件、底物特異性以及在細胞焦亡中的作用機制。利用結構生物學方法解析這些Caspase蛋白的三維結構和活性中心，深入了解它們的催化機制和調控機制。這些研究有助于揭示細胞焦亡的分子基礎，為開發相關藥物提供理論依據。

3.細胞生物學和分子生物學技術：

（1）形態學變化觀察：通過免疫熒光染色、透射電鏡觀察等手段，觀察細胞焦亡過程中的細胞膜破裂、染色質斷裂等現象。掃描電鏡是效果最好的形態檢測方法，可以清晰看到細胞腫脹、塌陷，并在細胞膜上觀察到很多明顯的孔洞。透射電鏡也能觀察到細胞器丟失、膜上有大量的孔隙。

（2）分子事件檢測：利用定量PCR、Western Blot等方法，檢測細胞焦亡過程中相關基因和蛋白的表達變化。例如，檢測Gasdermin D（GSDMD）被Caspase-1切割后的N端片段（約25-30kDa），可以明確GSDMD是否被激活。

（3）細胞活力檢測：使用CCK-8/MTT檢測方法或流式細胞術，對細胞活力進行定量分析和比較，輔助判斷細胞焦亡的發生。

4.電鏡觀察細胞形態：在細胞質膜破裂前，焦亡的細胞會形成大量小泡，即焦亡小體。之后細胞膜上會形成孔隙，細胞膜破裂，內容物流出。透射電鏡雖然沒有掃描電鏡清晰，但也能觀察到細胞器丟失、膜上有大量的孔隙。

5.檢測焦亡相關蛋白和炎癥因子：

蛋白檢測：通過Western Blot檢測Cleaved-caspase-1（p10亞基）的表達水平，可以直觀地判斷Caspase-1是否被激活。同時，檢測NLRP3蛋白的表達水平和焦亡小體的形成情況，可以判斷NLRP3炎癥小體是否被激活。

炎癥因子檢測：細胞焦亡的一個重要特征是炎性因子的釋放。利用ELISA試劑盒檢測IL-1β、IL-18等炎癥因子的水平，可以判斷細胞焦亡是否發生以及發生的程度。

總結

先獲取 GV/MII 期小鼠胚胎卵母細胞，用 H?O?、LPS 等誘導焦亡，設 GSDMD 抑制劑組對照；再用 mCherry-GSDMD 質粒、FAM-YVAD-FMK 探針等，結合共聚焦顯微鏡活細胞成像，監測 GSDMD 轉位、caspase-1/11 活化及膜完整性變化；后續檢測焦亡分子片段、促炎因子，關聯卵母細胞紡錘體完整性與受精率，實驗需維持生理培養環境。