使用 Cellspace-3D 培養肝癌類器官時，需結合微重力環境模擬、三維培養基質以及優化的培養條件，以實現高效擴增和功能維持。以下是具體操作要點及技術優勢分析：

一、核心操作步驟

1.細胞準備與接種

從肝癌組織或誘導多能干細胞（iPSCs）中分離原代細胞，制備單細胞懸液（濃度約1×10?細胞/mL）。

將細胞與低濃度基質膠（如Matrigel或OrganoGel）混合，避免高濃度基質膠限制細胞擴散。

將混合液滴加至預熱的24孔或96孔板中，每孔50μL，置于培養箱中凝固10分鐘。

2.三維培養條件優化

培養基：使用含關鍵生長因子（如CHIR99021、SB431542、BMP4、FGF4、EGF）的肝癌類器官專用培養基，支持細胞增殖與分化。

微重力模擬：通過Cellspace-3D的旋轉壁容器（RWV）或二軸回轉系統，消除重力主導的細胞沉降，促進細胞自發聚集形成三維球體。

低剪切力設計：優化培養基流動路徑，減少機械應力對細胞的損傷，維持細胞活性。

3.傳代與擴增

定期觀察類器官形態，當直徑達100-200μm時進行傳代。

使用溫和的細胞解離試劑（如TryplE）破壞基質膠，機械吹打或酶消化獲得單細胞懸液。

重新混合細胞與基質膠，按1:2-1:3比例傳代至新鮮孔板中。

二、技術優勢與實驗設計

1.模擬體內微環境

代謝梯度：類器官內部形成缺氧核心、營養梯度及藥物滲透屏障，與實體瘤特征高度一致。

細胞間相互作用：促進細胞通過緊密連接、縫隙連接和粘附分子（如E-鈣粘蛋白）建立物理聯系，形成具有功能的組織樣結構。

2.高通量藥物篩選潛力

結合微流控技術，可實現每日數萬級化合物的高通量篩選，加速抗肝癌藥物研發進程。

示例：在類器官模型中測試EGFR抑制劑的療效，評估藥物對腫瘤球體生長抑制的作用。

3.個體化醫療應用

利用患者來源的肝癌細胞構建3D模型，指導術后藥物選擇，提高治療成功率。

示例：通過CRISPR-Cas9編輯類器官中的特定基因（如TP53、CTNNB1），研究其在肝癌發生發展中的作用。

三、實際應用案例

華南理工大學研究：開發3D懸浮培養系統，利用低濃度Matrigel從人類胚胎干細胞（hESCs）中高效生成可擴展的肝芽類器官（HB-orgs）和成熟的極化肝細胞類器官（P-hep-orgs）。通過優化培養基成分（如CHIR99021、SB431542等），支持HB-orgs的長期擴增。

類器官與免疫細胞共培養：將肝癌類器官與T細胞或腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）共培養，模擬腫瘤免疫微環境，評估免疫檢查點抑制劑（如PD-1抗體）的療效。

四、注意事項與優化方向

營養擴散限制：球體中心區域易因營養/氧氣不足而壞死。解決方案包括引入微流控灌注系統或聲波操控技術，實現動態補充與代謝物清除。

規模化培養：開發高通量、自動化設備（如結合機器人系統）以滿足藥物篩選需求，同時建立3D細胞培養產品的質量標準（如ISO標準），加速FDA/EMA審批流程。

標準化與可重復性：優化培養條件（如旋轉速度、溫度、氣體濃度），減少實驗變量，提高類器官模型的穩定性。