免疫細胞體外培養是模擬體內生理微環境，實現 T 細胞、NK 細胞、巨噬細胞等免疫細胞體外活化、增殖與功能維持的核心技術，廣泛應用于腫瘤免疫治療（如 CAR-T 細胞制備）、感染免疫機制研究及自身免疫病藥物篩選。其核心目標是在體外環境中精準調控免疫細胞的生長狀態，確保細胞既保持高活性，又維持特異性免疫功能（如殺傷腫瘤細胞、分泌細胞因子），為基礎研究與臨床轉化搭建關鍵技術橋梁。

一、核心培養原理：適配免疫細胞的生理特性

免疫細胞與普通體細胞（如肝細胞）的最大差異在于其 “活化依賴性增殖” 特性 —— 需特定信號刺激才能從靜息態進入增殖周期，且功能維持高度依賴微環境信號。核心原理圍繞兩大關鍵點展開：

1.雙信號活化機制：以 T 細胞為例，體外培養需同時提供 “抗原信號” 與 “共刺激信號”：第一信號通過抗 CD3 抗體模擬 T 細胞受體（TCR）與抗原的結合，激活 TCR 信號通路；第二信號通過抗 CD28 抗體結合 T 細胞表面共刺激分子，避免 T 細胞活化后凋亡（即 “失能”）。缺少任一信號，T 細胞均無法有效增殖，甚至出現功能退化。

2.微環境穩態調控：免疫細胞對培養環境極其敏感，需嚴格控制三大參數：溫度維持 37±0.5℃（確保酶活性穩定），5% CO?濃度平衡培養基 pH（避免酸性環境抑制細胞活性），濕度≥95% 防止培養基蒸發濃縮；同時需全程無菌操作，因免疫細胞對細菌、支原體污染的耐受度極低，輕微污染即可導致細胞大量死亡或功能異常。

二、關鍵技術環節：從細胞分離到質量控制

免疫細胞體外培養需經過 “分離 - 活化 - 增殖 - 監測” 四大步驟，每個環節均需針對性優化操作：

1.細胞分離與純化：源頭細胞質量直接決定培養成敗，常用外周血、臍帶血或脾臟組織作為細胞來源。以人外周血為例，先通過 Ficoll-Hypaque 密度梯度離心（1500rpm 離心 20 分鐘）分離外周血單個核細胞（PBMC），去除紅細胞與血小板；再根據目標細胞類型選擇純化方法 —— 如用 CD3 磁珠陽性分選獲取 T 細胞（純度可達 95% 以上），用 CD56 磁珠分選 NK 細胞，避免雜細胞（如粒細胞、紅細胞）競爭營養或釋放抑制因子。

2.培養基與添加劑優化：基礎培養基多選用 RPMI-1640 或 IMDM（含必需氨基酸與維生素），需添加 10%~15% 胎牛血清（FBS，提供生長因子）或無血清替代物（避免血清批次差異干擾）。關鍵添加劑需根據細胞類型調整：培養 T 細胞時添加 10~20U/mL IL-2（維持增殖活性），培養 NK 細胞時補充 10ng/mL IL-15（增強殺傷功能），培養巨噬細胞時加入 20ng/mL GM-CSF（促進分化成熟）；同時需添加青霉素 - 鏈霉素雙抗（100U/mL）預防污染，避免使用高濃度抗生素（可能損傷細胞）。

3.活化與增殖調控：活化方式需匹配細胞類型：T 細胞采用 “抗 CD3/CD28 抗體包被培養瓶 + IL-2” 組合，包被濃度為 5μg/mL（4℃過夜），接種密度控制在 1×10?~2×10?個 /mL，密度過低易導致細胞聚集體形成困難，過高則營養不足；NK 細胞無需抗體包被，僅需 IL-15+IL-2 聯合刺激即可高效增殖，培養 7~10 天細胞數量可擴增 10~20 倍。增殖過程中需每 2~3 天半量換液，補充新鮮培養基與細胞因子，避免代謝廢物（如乳酸）積累抑制細胞生長。

4.質量監測指標：培養過程需定期檢測三大核心指標：① 細胞活率（臺盼藍染色法，活率需≥90%，低于 80% 需排查污染或營養問題）；② 表型純度（流式細胞術檢測，如 T 細胞需 CD3?比例≥90%，CAR-T 細胞需 CAR 陽性率≥70%）；③ 功能活性（如 NK 細胞對 K562 細胞的殺傷率，需≥50%；T 細胞分泌 IFN-γ 的水平，ELISA 檢測濃度≥100pg/mL），確保細胞符合后續實驗或臨床應用標準。

三、常見問題與解決方案

免疫細胞體外培養易面臨三大技術難題，需針對性解決：

1.細胞活性下降：常見原因包括培養基 pH 異常（多因 CO?濃度波動）、血清質量差或污染。解決方案：定期檢測培養基 pH（維持 7.2~7.4），選擇批次驗證合格的 FBS，培養前對所有試劑進行無菌檢測（如支原體 PCR 檢測），發現污染立即終止培養并消毒環境。

2.增殖效率低：多因活化信號不足或接種密度不當。若 T 細胞增殖緩慢，可提高抗 CD28 抗體包被濃度至 10μg/mL，或補充 5ng/mL IL-7 增強存活；若 NK 細胞擴增不足，可調整 IL-15 濃度至 20ng/mL，或采用 feeder 細胞（如照射后的 K562 細胞）共培養，提供額外刺激信號。

3.功能退化：如 T 細胞殺傷活性下降、巨噬細胞吞噬能力減弱，多因培養周期過長或細胞因子失衡。需控制培養周期（T 細胞不超過 14 天，NK 細胞不超過 21 天），在培養后期補充功能維持因子（如 T 細胞添加 IL-12 增強殺傷，巨噬細胞添加 LPS 維持吞噬活性）。

四、應用場景與技術趨勢

該技術已成為免疫領域的核心支撐技術，典型應用包括：在腫瘤免疫治療中，體外擴增 CAR-T 細胞或 NK 細胞，制備臨床級細胞制劑用于治療白血病、淋巴瘤；在感染研究中，培養巨噬細胞與病毒共孵育，觀察病毒復制對免疫細胞功能的影響；在藥物篩選中，構建免疫細胞 - 腫瘤細胞共培養模型，評估候選藥物對免疫細胞殺傷功能的增強作用。

未來技術將向 “精準化、規模化” 方向發展：通過微流控芯片構建仿生微環境（模擬體內淋巴結結構），提升細胞功能維持效率；開發自動化培養系統（如封閉式生物反應器），實現免疫細胞的規模化、標準化生產，減少人工操作誤差；結合基因編輯技術（如 CRISPR-Cas9 敲除免疫檢查點基因），進一步增強體外培養免疫細胞的抗腫瘤活性，推動免疫治療向更精準、更高效的方向發展。