光學顯微鏡中最容易被理解且經(jīng)常被忽略的概念之一可能是顯微鏡在照明方面的正確配置，這是實現(xiàn)最佳性能必須滿足的一個關鍵參數(shù)。照明源發(fā)出的光的強度和波長光譜非常重要，但更重要的是，將從燈絲上不同位置發(fā)出的光收集起來并聚焦在聚光鏡孔徑光闌的平面上。本交互式教程介紹了實現(xiàn)柯勒照明所需的燈絲和聚光鏡對準程序。

   本教程以出現(xiàn)在虛擬尼康顯微鏡視口中的隨機選擇的標本圖像以及通過光學序列的可變數(shù)量的照明進行初始化，該照明的強度級別取決于燈絲的（隨機）初始化狀態(tài)。本教程使用兩個窗口，可以使用“細絲對齊”和“聚光鏡對齊”單選按鈕訪問（切換）它們。假定虛擬顯微鏡使用10倍物鏡對初始選擇時隨機選擇的樣本或使用“選擇樣本”下拉菜單進行成像。該復位按鈕可用于重新初始化教程（選擇新的樣品和燈絲位置），而無需重新加載瀏覽器。

   為了操作本教程，請首先選擇“燈絲對齊”單選按鈕以在顯微鏡視口中顯示燈絲。可以使用（三個）滑塊的“燈絲控制”組來調節(jié)燈的強度（從零到12伏），聚焦（燈沿光軸的位置）以及燈相對于燈箱的旋轉軸。。此外，“細絲位置”滑塊沿著虛擬顯微鏡的x和y軸橫向平移細絲。

   將燈絲定心，聚焦并使其達到約9.0伏的工作電勢后，單擊“聚光鏡對準”單選按鈕以查看樣本和聚光鏡調節(jié)控制滑塊。如果燈泡的燈絲已正確調整，則無論聚焦狀態(tài)，聚光鏡高度或視場光闌開口大小如何，均應均勻照射樣品。要對準聚光鏡，請先使用“標本精細聚焦”滑塊聚焦標本，然后使用“聚光鏡高度”滑塊將視場光圈虹膜葉對準焦點。接下來，使用“聚光鏡橫向調整”滑塊將視場光闌的光圈開口平移到視口的中心。最后，使用膜片開口尺寸滑塊可將視場膜片打開至最大尺寸。如果光圈偏心打開，請使用x平移和y平移滑塊將開口置于視野的中心。或者，可以將鼠標光標放在小窗口（包含一組十字準線）中，并用于將視場光闌的圖像（顯示為白色圓圈）拖動到中心。在燈絲已正確對準并針對K?hler照明調整了虛擬顯微鏡之后，可以使用“聚光鏡孔徑”;滑塊來模擬數(shù)值孔徑的變化如何影響樣品對比度和分辨率。

   1800年代后期，August K?hler博士首先描述了目前公認的顯微鏡照明方法，并且在100多年后仍廣泛（幾乎專門）用于現(xiàn)代顯微鏡。科勒的技術需要聚光鏡在燈室內或附近，可以調節(jié)以將燈絲的圖像聚焦在孔徑光闌所在的聚光鏡的前焦平面上。如果燈絲圖像正確居中并完全充滿光圈，則樣品平面的照明將明亮且均勻。為了確保燈絲圖像出現(xiàn)在聚光鏡焦平面上，必須經(jīng)常調整聚光鏡本身的高度（本教程中介紹的一種技術）。這項關鍵的調整將兩組共軛焦平面（稱為場組和光圈組）帶入顯微鏡光學系統(tǒng)內的精確物理位置，并最大限度地提高了儀器的性能。