電荷耦合器件（CCD）或互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體（CMOS）圖像傳感器的最終分辨率取決于光電二極管的數(shù)量及其尺寸（相對(duì)于顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)投射到成像陣列表面的圖像的相對(duì)尺寸） 。當(dāng)嘗試使顯微鏡的光學(xué)分辨率與特定的數(shù)碼相機(jī)和視頻耦合器組合匹配時(shí)，請(qǐng)使用此計(jì)算器來確定從顯微鏡充分捕獲所有光學(xué)數(shù)據(jù)所需的最小像素密度。

   本教程使用出現(xiàn)在“標(biāo)本圖像” 窗口（黑匣子）中的隨機(jī)選擇的標(biāo)本進(jìn)行初始化，并以目鏡孔徑或投影透鏡視場(chǎng)光闌為界。指定CCD尺寸（默認(rèn)為2/3英寸）的彩色矩形疊加在圖像上，以顯示傳感器捕獲的樣本的實(shí)際區(qū)域。在滑塊下方的灰色，黃色和紅色框中，顯微鏡的光學(xué)分辨率（灰色），CCD所需的像素大小（黃色），最佳CCD陣列大小（黃色），顯示器放大倍數(shù)（紅色）和總放大倍數(shù)圖像的（紅色）以微米或產(chǎn)品表示。這些值在平移滑塊時(shí)不斷更新。可以使用“樣本圖像”窗口左側(cè)出現(xiàn)的單選按鈕來選擇新的CCD格式（尺寸）。所選傳感器的物理CCD尺寸（以毫米為單位）沿著與顯示芯片具有相同長(zhǎng)寬比的矩形顯示在圖像窗口的右側(cè)。

   為了操作本教程，請(qǐng)移動(dòng)“數(shù)值孔徑”和“物鏡放大率”滑塊（值顯示在滑塊上方），以設(shè)置要考慮的顯微鏡光學(xué)配置的適當(dāng)值。接下來，選擇一個(gè)目鏡或投影透鏡場(chǎng)編號(hào)（值范圍在18到26毫米之間）和視頻耦合器放大倍數(shù)（在0.5x到1.0x之間）。平移耦合器滑塊時(shí)，教程會(huì)更改疊加在樣本圖像上的矩形的大小，以匹配CCD傳感器捕獲的樣本區(qū)域。使用“選擇標(biāo)本”下拉菜單可以隨時(shí)選擇一個(gè)新標(biāo)本 。

   將光學(xué)顯微鏡產(chǎn)生的圖像捕獲到CCD或CMOS圖像傳感器的光電二極管陣列上的效率取決于幾個(gè)因素，從物鏡放大倍率，數(shù)值孔徑和分辨率到電子圖像傳感器光電二極管陣列的大小，縱橫比，視頻耦合器放大倍數(shù)以及陣列中各個(gè)感光元件的尺寸。此外，還必須考慮特定于所成像樣本的參數(shù)，例如對(duì)比度，信噪比，場(chǎng)景內(nèi)動(dòng)態(tài)范圍和積分時(shí)間。

   CCD的最終光學(xué)分辨率取決于光電二極管的數(shù)量及其尺寸（相對(duì)于顯微鏡透鏡系統(tǒng)投射到陣列表面的圖像的大小）的函數(shù)。當(dāng)前可用的CCD陣列的大小從幾百個(gè)像素到數(shù)千個(gè)像素不等。用于科研的設(shè)備中使用的現(xiàn)代陣列尺寸范圍從1000×1000到5000×5000傳感器元件。消費(fèi)級(jí)和科學(xué)級(jí)CCD的發(fā)展趨勢(shì)是傳感器尺寸不斷減小，目前可使用的光電二極管小至4×4微米。

   用顯微鏡的光學(xué)元件成像的標(biāo)本的足夠分辨率只有在每個(gè)可分辨單元至少制作兩個(gè)樣本的情況下才能實(shí)現(xiàn)，盡管許多研究人員更喜歡每個(gè)可分辨單元三個(gè)樣本以確保足夠的采樣。在諸如顯微鏡的衍射受限光學(xué)儀器中，當(dāng)使用數(shù)值孔徑為1.4的物鏡時(shí)，在平均可見光波長(zhǎng)（550納米）處的光學(xué)分辨率的阿貝極限為0.20微米。在這種情況下，10平方微米的傳感器尺寸恰好足夠大以允許光學(xué)和電子分辨率匹配，首選7×7微米的傳感器尺寸。盡管CCD圖像傳感器中較小的光電二極管可以改善空間分辨率，但它們也限制了器件的動(dòng)態(tài)范圍。

    表1-匹配顯微鏡光學(xué)分辨率的像素大小要求

   在顯微鏡下，圖像通常由光學(xué)系統(tǒng)投影到檢測(cè)器的表面上，該檢測(cè)器可以是人眼的視網(wǎng)膜，電圖像傳感器或傳統(tǒng)膠片上的敏感化學(xué)乳劑。為了優(yōu)化所得圖像的信息內(nèi)容，檢測(cè)器的分辨率必須與顯微鏡的分辨率緊密匹配。用于產(chǎn)生樣本圖像的可見光的波長(zhǎng)光譜是相對(duì)于光學(xué)分辨率而言顯微鏡性能的決定因素之一。與較長(zhǎng)的波長(zhǎng)（大于500納米）相比，較短的波長(zhǎng)（375-500納米）能夠更大程度地解析細(xì)節(jié)。空間分辨率的極限還取決于通過光學(xué)系統(tǒng)的光的衍射，該術(shù)語通常稱為衍射極限分辨率。研究人員推導(dǎo)出了幾個(gè)方程，這些方程已被用來表達(dá)數(shù)值孔徑，波長(zhǎng)和光學(xué)分辨率之間的關(guān)系：

   r=λ2×NA

   r=0.61×λNA

   r=1.22×λNAObj+NACond

   其中r是分辨率（兩個(gè)樣本點(diǎn)之間的最小可分辨距離），NA等于物鏡數(shù)值孔徑，λ等于波長(zhǎng)，NA（Obj）等于物鏡數(shù)值孔徑，而NA（Cond）是聚光鏡數(shù)值孔徑。注意，方程（1）和（2）由所述乘法因子，這是0.5方程不同（1）和0.61方程（2）。這些方程式基于許多因素，包括光學(xué)物理學(xué)家為解決物鏡和聚光鏡的行為而進(jìn)行的各種理論計(jì)算，不應(yīng)視為任何一項(xiàng)一般物理定律的絕對(duì)值。假設(shè)當(dāng)其中一個(gè)光源產(chǎn)生的艾里葉圓盤的中心與第二艾里葉圓盤的衍射圖中的一階反射重疊時(shí)，可以分辨（單獨(dú)成像）兩個(gè)點(diǎn)光源，這種條件稱為瑞利標(biāo)準(zhǔn)。在某些情況下，例如共聚焦和多光子熒光顯微鏡，分辨率實(shí)際上可能超過了這三個(gè)方程式中的任何一個(gè)所設(shè)定的極限。其他因素（例如較低的樣品對(duì)比度和不適當(dāng)?shù)恼彰鳎┛赡軙?huì)降低分辨率，并且往往會(huì)降低r的實(shí)際最大值（使用550納米的中光譜波長(zhǎng)，約為0.20微米）和數(shù)值孔徑在實(shí)踐中無法實(shí)現(xiàn)1.35至1.40的系數(shù)。

   當(dāng)徠卡顯微鏡完全對(duì)準(zhǔn)并且物鏡與載物臺(tái)下聚光鏡適當(dāng)匹配時(shí)，可以將物鏡的數(shù)值孔徑值代入方程式（1）和（2），將方程式（3）簡(jiǎn)化為方程式（2） ）。需要注意的重要概念是，在任何這些方程式中，放大率都不是一個(gè)因素，因?yàn)橹挥袛?shù)值孔徑和照明波長(zhǎng)決定了樣品的分辨率。如上所述（可以在方程式中觀察到），光的波長(zhǎng)是顯微鏡分辨率的重要因素。較短的波長(zhǎng)產(chǎn)生較高的分辨率（r的較低值），反之亦然。光學(xué)顯微鏡中最大的分辨力是通過近紫外光實(shí)現(xiàn)的，這是最短的有效成像波長(zhǎng)。近紫外光之后是藍(lán)色，然后是綠色，最后是紅色，可以分辨出樣品的細(xì)節(jié)。在大多數(shù)情況下，顯微鏡學(xué)家使用鎢鹵素?zé)襞莓a(chǎn)生的廣譜白光照射樣品。可見光譜的中心位于約550納米，這是綠光的主要波長(zhǎng)（我們的眼睛對(duì)綠光最敏感）。表1給出了用于計(jì)算本教程的分辨率值的波長(zhǎng)。數(shù)值孔徑值在這些方程式中也很重要，數(shù)值孔徑越高，分辨率也越高（請(qǐng)參見表1）。