結(jié)直腸癌（Colorectal Cancer, CRC）是全球第三大常見惡性腫瘤，也是癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一。傳統(tǒng)二維細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物模型雖在腫瘤研究中發(fā)揮了重要作用，但難以完全模擬人體腫瘤的異質(zhì)性、微環(huán)境交互及治療反應(yīng)。近年來，患者來源的腫瘤類器官（Patient-Derived Organoids, PDOs）技術(shù)因其能夠保留原始腫瘤的組織學(xué)特征、基因突變譜和藥物敏感性，成為腫瘤研究、個(gè)性化醫(yī)療及藥物篩選的革命性工具。
腸癌類器官通過從患者腫瘤組織中分離癌細(xì)胞，并在三維基質(zhì)膠中培養(yǎng)形成具有原發(fā)腫瘤特性的微型腫瘤模型，可高效復(fù)現(xiàn)腫瘤的增殖、分化、血管生成及耐藥性等關(guān)鍵生物學(xué)行為。相較于傳統(tǒng)模型，腸癌類器官具有以下優(yōu)勢(shì)：
1.高保真性：保留原始腫瘤的遺傳背景和細(xì)胞組成；
2.個(gè)性化應(yīng)用：支持個(gè)體化藥物敏感性測(cè)試，指導(dǎo)精準(zhǔn)治療；
3.可操作性：適用于基因編輯、共培養(yǎng)及高通量藥物篩選。
腸癌類器官培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)流程
1. 樣本獲取與處理
樣本來源：手術(shù)切除的結(jié)直腸癌組織、內(nèi)鏡活檢樣本或腹水/胸水中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞。
樣本處理：
無菌操作：在生物安全柜中用含抗生素的PBS沖洗樣本3次，去除血液和壞死組織。
機(jī)械剪切：將腫瘤組織剪碎至1-2 mm3碎塊，轉(zhuǎn)移至含膠原酶IV（2 mg/mL）或Dispase（1 U/mL）的消化液中，37℃振蕩消化30-60分鐘。
過濾分離：通過70 μm濾網(wǎng)過濾，收集單細(xì)胞或小團(tuán)塊，500×g離心5分鐘，棄上清。
2. 三維基質(zhì)膠包被
基質(zhì)膠準(zhǔn)備：將Matrigel或人工合成水凝膠于4℃解凍，按1:10比例與預(yù)冷的Advanced DMEM/F12培養(yǎng)基混合（避免氣泡）。
包被步驟：
在24孔培養(yǎng)板中每孔加入50 μL基質(zhì)膠混合液，37℃孵育30分鐘使其凝固。
凝固后，基質(zhì)膠表面形成半固體支撐層，用于類器官錨定生長(zhǎng)。
3. 類器官接種與初始培養(yǎng)
細(xì)胞接種：將消化后的腫瘤細(xì)胞（1000-5000個(gè)/孔）懸浮于50 μL培養(yǎng)基中，輕柔滴加至基質(zhì)膠表面，避免沖散膠層。
覆蓋培養(yǎng)基：加入預(yù)熱的完全培養(yǎng)基（500 μL/孔），配方需根據(jù)腫瘤類型調(diào)整：
基礎(chǔ)培養(yǎng)基：Advanced DMEM/F12 + 10% FBS（或無血清替代物）。
生長(zhǎng)因子：EGF（50 ng/mL）、Noggin（100 ng/mL）、R-spondin1（500 ng/mL，激活Wnt通路）。
其他添加劑：Y-27632（10 μM，抑制ROCK通路，提高細(xì)胞存活率）、抗生素（青霉素/鏈霉素）。
4. 培養(yǎng)條件與觀察
培養(yǎng)環(huán)境：37℃、5% CO?、飽和濕度。
培養(yǎng)基更換：每3-4天半量更換培養(yǎng)基，避免類器官脫離基質(zhì)膠。
形態(tài)學(xué)觀察：
早期（3-7天）：細(xì)胞聚集形成實(shí)心球體。
中期（7-14天）：球體內(nèi)部出現(xiàn)囊腔結(jié)構(gòu)，模擬腫瘤腺體形成。
長(zhǎng)期（>14天）：類器官直徑可達(dá)200-500 μm，需傳代以維持活性。
5. 類器官傳代與擴(kuò)增
傳代時(shí)機(jī)：當(dāng)類器官直徑超過500 μm或培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)耗盡時(shí)（約每2-3周）。
傳代步驟：
吸除舊培養(yǎng)基，用冷PBS沖洗2次。
加入基質(zhì)膠消化液（如Dispase，2 mg/mL）37℃孵育20分鐘，直至基質(zhì)膠溶解。
收集類器官至15 mL離心管，500×g離心5分鐘，棄上清。
用TrypLE或Accutase于37℃消化5-10分鐘，形成單細(xì)胞或小團(tuán)塊（避免過度消化）。
離心后重懸于新鮮基質(zhì)膠中，按1:3比例傳代至新培養(yǎng)板。
6. 功能驗(yàn)證與檢測(cè)
形態(tài)學(xué)驗(yàn)證：顯微鏡下觀察類器官的腺腔結(jié)構(gòu)、細(xì)胞極性及核異型性是否與原始腫瘤一致。
免疫熒光染色：檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物（如CK20、CDX2、β-catenin）及干細(xì)胞標(biāo)記物（LGR5、OLFM4）。
基因測(cè)序：通過全外顯子測(cè)序（WES）或靶向測(cè)序驗(yàn)證類器官與原始腫瘤的突變一致性（如KRAS、BRAF、TP53突變）。
藥物敏感性測(cè)試：將類器官暴露于不同化療藥物（如5-FU、奧沙利鉑）或靶向藥物（如EGFR抑制劑），通過ATP檢測(cè)或細(xì)胞活力分析評(píng)估療效。
注意事項(xiàng)與常見問題
樣本質(zhì)量：優(yōu)先選擇新鮮、無壞死組織的腫瘤樣本，避免使用放療/化療后的組織。
基質(zhì)膠選擇：低生長(zhǎng)因子基質(zhì)膠可減少對(duì)類器官分化的干擾。
污染控制：全程無菌操作，培養(yǎng)基中添加抗生素，定期觀察是否出現(xiàn)細(xì)菌/真菌污染。
傳代優(yōu)化：根據(jù)類器官密度調(diào)整消化時(shí)間，避免過度機(jī)械損傷導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
個(gè)體差異：不同患者來源的類器官對(duì)培養(yǎng)條件的響應(yīng)可能不同，需個(gè)性化優(yōu)化。
總結(jié)
腸癌類器官技術(shù)為腫瘤生物學(xué)研究、藥物開發(fā)及個(gè)性化治療提供了前所未有的工具。通過標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng)流程，研究人員可高效構(gòu)建具有臨床相關(guān)性的腫瘤模型，深入解析腫瘤異質(zhì)性、耐藥機(jī)制及微環(huán)境交互。未來，隨著類器官與單細(xì)胞測(cè)序、類器官芯片等技術(shù)的結(jié)合，腸癌類器官將在精準(zhǔn)醫(yī)療和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中發(fā)揮更關(guān)鍵的作用，最終推動(dòng)結(jié)直腸癌治療策略的革新。
