懸浮細胞（如淋巴細胞、造血干細胞、腫瘤細胞系等）因不貼壁生長的特性，在培養過程中易因營養匱乏、代謝廢物積累或環境應激產生死細胞。死細胞釋放的核酸、蛋白等內容物不僅會污染培養體系，還會干擾細胞活性檢測、后續分選及功能實驗結果。因此，高效、低損傷地去除懸浮細胞中的死細胞，是細胞生物學研究與臨床應用（如細胞治療）的關鍵環節。本文將系統梳理主流去除技術的原理、操作要點及適用場景，為實驗設計提供參考。

一、密度梯度離心：基于密度差異的經典分離法

密度梯度離心是利用死細胞與活細胞密度差異實現分離的傳統技術，核心原理是：活細胞因胞膜完整、胞質密度均一（約 1.05~1.07 g/cm3），可在特定密度的梯度介質中遷移至對應密度層；而死細胞因胞膜破損、內容物流失，密度降低（約 1.02~1.04 g/cm3）或因吸水腫脹密度異常，最終停留在梯度上層或沉淀于管底。

常用的梯度介質包括Ficoll-Paque（密度 1.077 g/cm3）和Percoll（可調節密度范圍 1.000~1.130 g/cm3）。以淋巴細胞分離為例，操作步驟為：將細胞懸液與 Ficoll-Paque 按 1:1 體積疊加，在室溫下以 400×g 離心 30 分鐘，離心后體系形成四層 —— 上層為血漿 / 培養基，中層為 Ficoll-Paque，下層為紅細胞 / 粒細胞沉淀，而活淋巴細胞則富集于中層與下層的界面，死細胞則主要分布在上層。該方法操作簡便、成本低，單次可處理 10?~10?個細胞，活細胞回收率可達 80% 以上，適用于大規模細胞樣本的初步純化（如外周血單個核細胞 PBMC 的分離）。

但需注意：Ficoll-Paque 的高滲透壓可能對敏感細胞（如干細胞）造成損傷，需后續用生理鹽水洗滌 2~3 次；而 Percoll 因滲透壓與細胞內環境更接近，更適合脆弱細胞的分離，但價格較高且需提前制備連續密度梯度，操作稍復雜。

二、免疫磁珠分選：基于表面標志物的特異性去除

免疫磁珠分選（MACS）利用死細胞表面特有的抗原標志物（如磷脂酰絲氨酸 PS、壞死細胞特異性蛋白），通過特異性抗體 - 磁珠復合物實現靶向去除，核心優勢是高特異性（僅識別死細胞）和低損傷性（對活細胞活性影響 < 5%）。

最常用的靶點是磷脂酰絲氨酸（PS） —— 活細胞的 PS 僅分布于胞膜內側，死細胞（尤其是早期凋亡細胞）因胞膜外翻，PS 暴露于表面。將偶聯抗 PS 抗體的磁性微球（直徑 50~100 nm）與細胞懸液孵育 15~20 分鐘后，置于磁場中，死細胞因結合磁珠被吸附在管壁，活細胞則隨上清液收集。該方法可將死細胞比例從 30% 以上降至 5% 以下，且不影響活細胞的增殖與功能，適用于對純度要求高的實驗（如 CAR-T 細胞制備中死細胞的去除）。

此外，針對完全壞死的細胞，可選擇靶向 “壞死細胞特異性 DNA 片段” 或 “損傷胞膜蛋白” 的磁珠，進一步提升分離精度。但需注意：抗體 - 磁珠復合物的孵育溫度需控制在 4℃（避免非特異性結合），且磁珠濃度需優化（過量磁珠可能導致活細胞非特異性吸附），單次處理細胞量通常不超過 10?個，更適合中小規模樣本。

三、過濾法與流式細胞術：從物理篩選到高精度分選

1. 過濾法：基于細胞大小與完整性的快速篩選

懸浮細胞中，死細胞因胞膜破損易發生腫脹（直徑增大 20%~30%）或皺縮（直徑減小 15%~20%），而活細胞大小均一、形態完整。利用孔徑為 70~100 μm 的細胞篩網（如尼龍網、聚碳酸酯膜）過濾細胞懸液，可通過物理攔截去除過大的腫脹死細胞或細胞碎片；若需進一步去除過小的皺縮死細胞，可采用 “兩步過濾法”—— 先通過 100 μm 篩網去除大碎片，再通過 40 μm 篩網保留活細胞（通?；罴毎睆皆?10~20 μm）。

該方法操作最快（單次處理僅需 5~10 分鐘）、無化學試劑干擾，適用于緊急實驗中快速去除大量死細胞碎片（如病毒感染后的細胞樣本處理），但缺點是特異性低，若活細胞與死細胞大小重疊（如小體積凋亡細胞），易導致活細胞損失（回收率約 60%~70%），僅適合對純度要求不高的場景。

2. 流式細胞術：基于多參數的高精度分選

流式細胞術（FCM）通過熒光標記區分活細胞與死細胞，可實現 “多參數篩選 + 高精度分選”，是目前純度最高的去除技術（活細胞純度可達 99% 以上）。常用的熒光染料包括：活細胞染料（如 Calcein-AM，進入活細胞后被酯酶水解發出綠色熒光）和死細胞染料（如 PI，僅穿透破損胞膜與 DNA 結合發出紅色熒光）。

操作時，將染色后的細胞懸液注入流式細胞儀，儀器通過激光檢測熒光信號，僅收集 “Calcein-AM 陽性、PI 陰性” 的活細胞。該方法可同時分析細胞大小、顆粒度等參數，進一步排除異常細胞，且可實現單細胞水平的分選，適用于稀有細胞（如造血干細胞、循環腫瘤細胞）的純化。但缺點是設備成本高（需流式細胞分選儀）、處理量?。▎未巫畲筇幚?10?個細胞）、且激光照射可能對部分細胞的功能產生輕微影響（如免疫細胞的活化狀態），需在分選后進行活性驗證。

四、技術選擇策略與關鍵注意事項

選擇死細胞去除技術時，需綜合考慮細胞類型、樣本規模、純度需求及實驗成本：若為大規模常規樣本（如 PBMC 分離），優先選密度梯度離心；若為敏感細胞或高純度需求（如細胞治療），選免疫磁珠分選；若需快速處理或緊急實驗，選過濾法；若為稀有細胞或高精度研究，選流式細胞術。

此外，需注意三大關鍵要點：一是細胞活性保護—— 所有操作需在無菌環境下進行，離心轉速不超過 500×g（避免胞膜損傷），孵育試劑需提前平衡至室溫；二是死細胞比例評估—— 處理前后需用臺盼藍染色或熒光染料（如 PI/Calcein-AM）檢測死細胞比例，確保去除效果；三是后續驗證—— 對純化后的活細胞，需通過細胞計數、增殖實驗（如 CCK-8 法）或功能檢測（如淋巴細胞殺傷實驗）驗證活性，避免技術過程對細胞功能的影響。

總結

懸浮細胞死細胞去除技術已從傳統的物理分離（密度梯度、過濾）向特異性靶向（免疫磁珠）和高精度分選（流式細胞術）發展。不同技術各有優劣，需根據實驗需求靈活選擇。未來，隨著微流控技術的發展（如基于微芯片的細胞分選芯片），有望實現 “高通量、低損傷、自動化” 的死細胞去除，進一步推動懸浮細胞在基礎研究與臨床應用中的轉化。